Huntingtonova choroba je smrtelná dědičná nemoc. Lék na ni zatím neexistuje. Michaela Vaškovičová zkoumá mechanismus této choroby na transgenních miniprasatech. Otevírá tak jedny z dveří k budoucí léčbě lidí.
Smrtelná a neléčitelná Huntingtonova choroba má prostou příčinu: mutaci jediného genu. Protein huntingtin, který je kódovaný tímto genem, se vyskytuje ve všech buňkách lidského těla a pro organismus je nezbytný. „Mutace v tomto genu způsobí, že dříve užitečná bílkovina začne škodit buňkám, především neuronům,“ vysvětluje profesor Jan Motlík z Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, kde se snaží porozumět zákonitosti choroby, ale i hledat možné cesty nápravy.
Zhoubná mutace se přenáší z rodičů na děti dominantě – v případě mutace genu pro huntingtin u rodiče má potomek padesátiprocentní „šanci“, že chorobu zdědí. Nemoc se začne projevovat poměrně pozdě, kolem čtyřicátého roku. Zprvu se nenápadně začíná měnit osobnost nemocného, může být agresívní, depresivní. Postižený, rodina ani lékaři ještě nemusí tušit, proč. Když dojde k poškození mozkových center pro koordinaci, nemocný začne mít problémy s pohybem, neovládá ruce ani nohy. Neurony postupně odumírají ve všech částech mozku. Pokročilejším projevem nemoci je demence, po ní následuje smrt. Nemocný umírá do deseti až dvaceti let od prvních příznaků.
Byť známe dědičné pozadí nemoci a víme, že za ni může mutace jen jediného genu, dosud neexistuje žádný lék, který by její rozvoj zastavil nebo aspoň výrazně zpomalil.
Zvířata modelem
Huntingtonova choroba postihuje až deset lidí ze sta tisíce. Proto se ocitla v hledáčku vědců na celém světě. Vzhledem k tomu, že gen kódující bílkovinu huntingtin se vyskytuje u všech eukaryot, a tedy i u všech obratlovců, nabízí se zde možnost studovat mechanismus onemocnění i cesty, jak opravit vadný gen či zastavit proces odumírání nervových buněk – na laboratorních zvířatech.
„Mnoho vědeckých týmů ve světě studuje tuto nemoc na myších. Myš je ale velmi vzdálená člověku, proto se hledají i modely člověku bližší. Prasata, ovce, primáti. V Ústavu živočišné fyziologie a genetiky jsou tímto modelem uměle vytvořená transgenní miniprasata“, říká Michaela Vaškovičová, doktorandka Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy, která zde právě s prasečím modelem pracuje.
Tím, že vědci vnesou mutovaný lidský gen do organismu prasat, získají možnost, jak studovat molekulární a genetické zákonitosti lidských chorob i jejich klinické projevy. Transgenní prasata coby model lidské Huntingtonovy choroby zde chovají od roku 2009.
„Již jiní vědci před námi zjistili, že huntingtin by mohl ovlivňovat stabilitu genomu lidí se zděděnou mutací. Že se u nich patrně špatným způsobem opravuje DNA. I u zdravého člověka v každé buňce dochází denně k mnoha poruchám, zlomům DNA, ale buňka je schopna chyby opravit. Ale pokud proces oprav nefunguje, chyby se hromadí a buňka se rozhodne, že zvolí cestu smrti (buněčná apoptóza). Předpokládá se, že mutovaný protein huntingtin je pro buňky toxický a neurony takto umírají o to snáz.“
Michaela Vaškovičová se s kolegy zajímá nejvíce o jedno konkrétní poškození DNA. „Snažíme se pochopit dvojřetězcové zlomy DNA, jeden z nejvážnějších typů poškození DNA. Když se rozpojí oba řetězce, znamená to pro buňku velké nebezpečí, protože může dojít k nesprávnému spojení konců šroubovice, nebo může dojít ke zlomu celého chromozomu.“
Vaškovičová využívá k výzkumu namnožené kožní buňky pocházející od prasat, do jejichž genomu vědci vnesli pozměněný gen kódující bílkovinu huntingtin. Jako marker pro identifikaci dvojřetězcových zlomů DNA vědkyni slouží molekula fosforylovaného histonu H2AX a další, které jsou aktivní v procesu oprav zlomů DNA. Jejich chování sleduje pomocí metody imunoflorescence. „K buňkám rostoucím na podložním sklíčku přidám tzv. primární protilátku, která specificky rozpoznává hledanou molekulu. Poté přidám sekundární protilátku, která obsahuje fluorescenční barvivo a rozpozná primární protilátku. Přítomnost fluorescenčního barviva mi následně umožňuje sledovat přítomnost a umístění hledané molekuly pomocí fluorescenčního nebo konfokálního mikroskopu,“ vysvětluje.
Zlomy v DNA vytváří chemicky, antibiotikem neokarcinostatinem. Zároveň vědci sledují pro srovnání i kontrolní zvířata, většinou zdravé prasečí sourozence, které mutovaný gen nezdědili.
Od prasat k lidem
Na transgenních prasatech pro Huntingtonovu chorobu ve světě pracuje jen několik málo laboratoří (v německé využívají miniprasata z Liběchova), neboť vytvořit prase potřebných vlastností je komplikované, finančně velmi náročné. Proto vědcům slouží, i přes její biologickou vzdálenost od člověka, jako model častěji myš. Americká nadace CHDI (dřívější název Cure Huntington ´s Disease Initiative) testuje možné léčebné postupy i na primátech. „Opice a primáti jsou samozřejmě nejpodobnější lidem, mohou tak přivést vědce nejrychleji k cíli, ale na druhou stranu je používání těchto zvířat k výzkumům eticky nejproblematičtější. V Evropské unii už sílí snaha makaky nebo šimpanze jako modely lidských chorob vůbec nevyužívat,“ vysvětluje Michaela Vaškovičová. Prasata tak získávají.
Kromě experimentů na zvířatech však ve světě v současnosti probíhá i mnoho klinických studií, které hledají léky na zmírnění příznaků. Řada z nich se už používá i v praxi. „Některé výsledky jsou poměrně nadějné,“ dodává Vaškovičová, „ale lék, který by Huntingtonovu chorobu vyléčil, stále neexistuje.“
I práce vědců v Liběchově by mohla ze sféry základního výzkumu přejít do klinických studií. Nejblíže je projekt spolupráce s holandskou firmou uniQure, která se zabývá genovou terapií. Konstrukty, jež měly bránit vzniku mutovaného huntingtinu na úrovni přepisu RNA do proteinu (nedocházelo by k vytváření mutovaného proteinu) se rovněž testovaly na liběchovických miniprasatech.
Pokud výsledky prokáží bezpečnost tohoto postupu, přikročí se k dalším testům na miniprasatech, což může v konečném výsledku vést ke klinickým testům. Naděje na úspěšný lék se tak možná o krok přiblíží.
Přenos genů
V první linii vnesou vědci mutovaný gen do zygoty (buňky, která vznikne splynutím vajíčka a spermie). Geneticky modifikované zygoty se poté přenesou do dělohy matky-příjemkyně. Narozená mláďata mají mutaci zabudovanou do svého genomu a přenášejí ji tak do další generace. V Liběchově se narodilo již pět generací transgenních prasat. Necelá polovina potomků nese upravený mutovaný gen, který způsobuje u lidí Huntingtonovu chorobu.
Genová terapie
Genová terapie je potenciálně velmi účinný léčebný postup. Do genomu pacienta se vloží zdravý, funkční gen, který nahradí gen chybějící nebo vadný. Tato metoda se považuje za velmi nadějnou zejména u genetických onemocnění, způsobených defektem jediného genu jakou je právě Huntingtonova choroba.
Poprvé byla genová terapie použita v roce 1990 u nemoci, jež se projevuje vážnou poruchou imunity. Jakožto příliš riskantní a komplikovaný byl tento postup zatím pozastaven. U Huntingtonovy choroby se zkouší jiný způsob: do genomu pacienta by se žádný gen nevnášel, ale cílem je vytvořit takové umělé mikro-RNA, které umlčují gen pro huntingtin, takže by se vadný (toxický) protein v buňkách vůbec netvořil.
Rozhovor s genetikem Janem Motlíkem: Miniprase je nám, lidem, velmi blízko
Kdy jste v Liběchově poprvé pomysleli na genově upravená zvířata?
Izolaci, kultivaci a diferenciaci nervových buněk miniprasat jsme se věnovali od roku 2000. Chtěli jsme vědět, za jakých podmínek in vitro jsme schopni získat všechny buněčné typy v nervové tkáni. Na základě výsledků publikovaných v renomovaných neurologických časopisech jsme navázali spolupráci se špičkovými laboratořemi v Miláně, Bostonu a San Diegu. Tento „kvartet“, za nějž jsem byl zodpovědný, získal významnou podporu od americké nadace CHDI Foundation na podporu výzkumu Huntingtonovy choroby. Bez ní jsme měli jen malou šanci na úspěch při tvorbě transgenního miniprasete.
Proč zrovna transgenní miniprase?
Miniprase je jedinečný biomedicínský model. Je nám lidem velmi blízko, a proto velmi dobře slouží pro důkladné ověření všech navržených léčebných postupů. Pro testování všech metod léčení je velkou výhodou, že v každém vrhu jsou stejným dílem selata zdravá a transgenní, díky čemuž můžeme přímo srovnávat efekt léčby.
Ve Výzkumném centru PIGMOD se narodily již čtyři generace transgenních miniprasat, náš transgenní chov disponuje vice než dvěma sty miniprasaty.
Jaké oblasti úpravy genů jste si vybrali a proč?
Do lentivirového vektoru jsme vložili informace pro část lidského genu, který kóduje bílkovinu huntingtin. Protože Huntingtonova choroba je způsobena především mutací v jednom genu, je vytvoření modelu pro tuto chorobu relativně „jednoduché“. Po několika letech soustředěné práce všech týmů se v Liběchově narodila v červenci 2009 Adela. Hned v prvním vrhu se dubnu 2010 Adele narodili tři transgenní kanečci. Bruno a Babe se pak stali zakladateli dalších generací.
O Vaše prasata je velký zájem i mimo brány ústavu…
Zájem o spolupráci na tomto modelu mají jak vědecké instituce, například německý Ústav G. Huntingtona, tak farmakologické společností jako holandský uniQure. Biologický materiál z transgenních miniprasat putuje i k zahraničním kolegům na Bostonské univerzitě. Laboratoře Centra PIGMOD získaly velmi prestižní grant v Programu Česko-norské spolupráce, který je zaměřený na komplexní studium Huntingtonovy choroby jak u pacientů, tak na modelových zvířatech. Buňky a tkáně transgenních miniprasat představují jedinečný zdroj informací, které získáváme při společných experimentech s kolegy z university v Oslu.
Vaše prasata slouží i pro výzkum léčení míchy po úrazech s využitím kmenových buněk. Co se u Vás na tomto poli děje?
S americkými kolegy testujeme nové postupy při léčbě poškození míchy, naše metodika umožňuje výrazně zvýšit objem a také koncentraci kmenových buněk v místě poškození. To je nesmírně důležité, protože v místě poranění míchy dochází v některých případech ke značné ztrátě původní nervové tkáně v důsledku zánětlivého procesu. Naše spolupráce je zaměřena na preklinické miniprasečí experimenty testování léčby poškozené míchy pomocí kmenových buněk nebo určitých virových konstruktů, které jsou schopny zvýšit nebo snížit produkci jednotlivých velice důležitých, a pro jednotlivé fáze poškození míchy specifických pro- nebo proti-zánětlivých růstových faktorů.
Podařilo se něco z Vaší práce posunout ze sféry základního výzkumu do klinického výzkumu? Co považujete za největší úspěch?
Co se týče výzkumu poškození míchy a terapie kmenových buněk, v Centru PIGMOD si nejvíc považujeme úspěšného provedení preklinických miniprasečích experimentů s neurálními kmenovými buňkami. Ve spolupráci s Universitou v San Diegu a s firmou Neuralstem jsme dlouhodobě testovali úspěšnost a bezpečnost použití buněk, které se po transplantaci do poškozené míšní tkáně diferencují do nervových buněk míchy. Tyto náročné experimenty na miniprasatech vedly k tomu, že americký úřad FDA povolil použití těchto buněk pro klinickou terapii pacientů s poškozením míchy.
Nyní jsme po dvou letech spolupráce s firmou uniQure získali potřebně experimentální výsledky na miniprasatech transgenních pro lidský mutovaný huntingtin. Přinášejí naději, že genová terapie by mohla v budoucnu zastavit rozvoj Huntingtonovy choroby, tohoto fatálního onemocnění.
Prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc (*1946) je výzkumným pracovníkem Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR a špičkovým odborníkem s mezinárodním renomé v oboru fyziologie reprodukce a výzkumu kmenových buněk.
Autorka je redaktorkou časopisu Vesmír/vesmir.cz